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酶標(biāo)醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)
更新時間:2011-09-08 點擊量:1125

酶標(biāo)醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)

一,酶標(biāo)醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)的原理

由于醋酸纖維膜是由醋酸纖維素組成的,對蛋白質(zhì)分子的移動幾乎無阻力,差不多所有在電場中能泳動的物質(zhì)均能在醋酸纖維膜里自由移動,因此在免疫電泳中,醋酸纖維膜是一優(yōu)良的載體。將酶標(biāo)記抗體與相應(yīng)抗原在醋酸纖維膜進(jìn)行電泳,生成免疫復(fù)合物,用酶底物顯色,能大幅度地提高檢測的靈敏度和可靠性。使用酶標(biāo)醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)(Enzyme-Linked-Cellulosa-Acetate-membrane-Immunoelectropheresis,簡稱ELCAIE),筆者文章公布的檢出量是0.3ngRMV,其實當(dāng)時的實驗結(jié)果已經(jīng)顯示0.1ngRMV檢測量。

二,酶標(biāo)醋酸纖維膜免疫電泳技術(shù)的程序(檢測RMV

1,器材與設(shè)備

1)電泳儀(包括電泳槽);

2)醋酸纖維膜(10cm×14cm,厚度10dmm;

3)微量進(jìn)樣器;

4)竹鉗。

2,材料與試劑

(1)       0.2mol/LpH7.2硼酸緩沖液連續(xù)稀釋的RMV溶液(10ng/ml1×10ng/ml);

(2)       HRP標(biāo)記的RMV免疫的兔IgG(戊二醛一步法交聯(lián);

(3)       洗滌液,每1000ml中有500ml 0.1mol pH8.2巴比妥緩沖液和85g食鹽,其余為蒸餾水;

(4)       底物與供氫體溶液(H2O2DAB4HC1);

(5)       0.1mol/L pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液。

 3,實驗程序

(1)       將醋酸纖維膜用軟鉛筆輕輕劃好點樣線,酶標(biāo)抗體樣點距膜邊3cm,抗原樣點與酶標(biāo)抗體樣點對距3cm,兩個樣點橫距1.5cm.

(2)       將上述薄膜浸入0.1mol/L pH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液中浸濕,取出薄膜,用濾紙吸去表面水分,但不要干燥。

(3)       用微量進(jìn)樣器點樣,抗體每樣點用酶標(biāo)抗體液10ul,抗原樣點*點是對照,滴加10ul健青菜蛋白溶液;第二、三、四、五樣點滴加RMV抗原溶液各10ul,濃度分別為1×10ng/ml1×10ng/ml、1×10ng/ml、100ng/ml;第六、七樣點分別滴加5ul3ul、,濃度為100ng/ml;第八樣點滴加10ul,濃度為10ng/ml;第九樣點滴加5ul,濃度為10ng/ml.

(4)       點樣完畢,將薄膜置于電泳槽中央棱邊,使其架空,然后用濾紙作鹽橋,電泳緩沖液為0.1mol/L PH8.6巴比妥鈉鹽酸緩沖液,抗原端接負(fù)極。

(5)       待作為鹽橋的濾紙全部濕潤后,接通電源,控制電壓150V,電泳時間1.5h左右。

(6)       電泳完畢,將薄膜浸洗在洗滌中過夜。

(7)       次日將薄膜在清水中漂洗35min后取出。

(8)       zui后滴加H2O20.3%)和DAB4HC1溶液,各占一半量,幾分鐘內(nèi)就會顯示結(jié)果。

 

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